Micronuclei(fr)
MICRONOYAUX
Protocole pour tests de micronoyaux sur cellules buccales
par Rachel Aronoff pour les projets de l'intégrité génomique au Hackuarium.
(avec aide traductions :-) par Anne-Laure Pittet et Juliette Lemaignen)
(Comme tous les microbiologistes moléculaires le savent, chaque chercheur aura sa propre manière de faire… à notre avis plusieurs méthodes sont possibles et devraient être diffuses.)
Un protocole de recherche « Do-It-Together (DIT)» c’est-à-dire « à faire ensemble » pour rechercher des micronoyaux dans ses propres cellules buccales
Remarque: le travail se fait idéalement au moins en binôme de façon à pouvoir échanger lames pour le décompte des cellules après la préparation. Ceci permet d'éviter tout biais.
Protocole:
- Bien rincer la bouche avec de l'eau
- Utiliser une brosse à dents pour recueillir délicatement les cellules de la surface interne de la joue
- Rincer la brosse à dents avec environ 10 ml de solution saline dans un petit bécher de façon à collecter les cellules
- Verser le liquide dans un tube conique de 15 ml pour permettre aux plus grosses amas de cellules de se déposer et
- Mettre la meilleure partie du liquide (evitant les amas en bas) dans deux tubes de microcentrifugation
- Centrifuger doucement (pas plus de 5 000 rpm / min) pendant 3 min
- Verser les surnageants et répéter jusqu'à ce que toutes les cellules soient recueillies
- rassemblerles cellules des deux tubes dans un seul tube, dans environ 200ul de solution saline
- Obtenir la concentration des cellules de cette solution (but à atteindre: 2000-5000 cellules par lame), en utilisant un hémocytomètre.
- Déposer 10ul pour compter sur l'hémocytomètre (le calcul est le suivant, si vous comptez plusieurs cellules (X) de la taille du carré principal = (X * # cellules / X) par carré principal x10 ^ 4 / ml)
- Si nécessaire, centrifuger à nouveau pour concentrer les cellules dans un petit volume, puisqu' idéalement, les ’smears' (ou 'raclements' des cellules) déposeront sur chaque lame des gouttes de moins de 50-100 μl, contenant environ 2000 cellules.
- Assurez-vous que les lames sont propres et étiquetées avant de procéder aux ’smears' ou raclements des cellules
(à montrer au course des ateliers)
- Déposer une goutte aux 3/4 environ à la fin de la lame puis, avec le bord d'une deuxième lame propre, déplacer la goutte vers l'arrière, puis l'étaler (racler) sur tout l'avant de la lame (voir images)
- Laissez chaque lame sécher à l’air (on peut placer sur une plaque chaude).
- Fixer les cellules à la lame en passant brièvement celle-ci au-dessus d'une flamme (enlever la suie du bas avant de passer à la coloration).
(Fixation facultative avec du méthanol: acide acétique 3:1).
- Colorer les cellules avec du bleu de méthylène (solution aqueuse à 0,5% et pour le fixation optionnelle – solution préparée dans de l'éthanol ...)
Si vous avez des conteneurs de trempage pour les lames (cuvettes de coplin), c'est bien. Sinon vous pouvez juste verser une goutte sur la lame. Laisser la tache sur au moins 1 min puis rincer avec des gouttes d'eau, en recueillant le liquide de déchet bleu (déchet)* dans un bécher. Laisser sécher l'échantillon et examiner au microscope à un grossissement d'environ 200x.
La quantification est cruciale - les micronoyaux peuvent provenir de processus normaux, mais une augmentation de 2-4 / 1000 à 20 ou plus pour 1000 cellules de la joue pourrait signifier qu'on devrait considérer des expositions environnementales délétères ...
La figure 1 montre un exemple de cellule de joue contenant un micronoyau, étalé, fixé et coloré simplement avec du bleu de méthylène.